2024-04-10
文章题目: Microenvironment-responsive metal-phenolic network release platform with ROS scavenging, anti-pyroptosis, and ECM regeneration for intervertebral disc degeneration
技术手段：转录组测序、SEM 和TEM、细胞活性评估、荧光染色、RT-qPCR等
中南大学湘雅三医院，邓幼文教授团队在《Bioactive Materials》上发表了基于当前IVDD的治疗困境，创新性的开发了一款多功能微环境响应型的金属酚网络释放平台的研究成果。
本研究的转录组测序和部分数据分析工作由云顶国际亚洲唯一官网生物科技股份有限公司完成。
研究背景
椎间盘退变(IVDD)是一种以一系列病理改变为特征的复杂疾病，对生活质量和健康产生负面影响，虽然保守治疗可以有效缓解疼痛，但并不能减缓IVDD的进展因此，单靶点治疗是不够的。因此，为了有效治疗IVDD，迫切需要开发多靶点药物治疗。
越来越多的证据表明，IVDD与氧化应激产生、细胞焦亡和细胞外基质(ECM)降解密切相关。活性氧(ROS)过量，主要由线粒体产生，可引起组织损伤。
本研究拟通过以TA（单宁酸）、锰和聚乙烯吡罗烷酮(PVP)为原料，通过自组装，开发具有高效ROS清除活性的TA衍生金属-酚类网络(TA- mn -PVP, TMP)，并评估其对IL-1β诱导的IVDD的疗效。
平台制备方法、椎间盘注射及治疗效果示意图
技术路线
主要研究结果
1.能量代谢产物和酶活性的变化
为了更好地了解IVDD发病时组织发生的病理变化，本研究收集了IVDD患者的髓核组织标本。通过MRI图像，番红-固绿染色，免疫组织化学，半定量以及IVD组织中关键的焦亡相关蛋白的表达评估等方法，这些结果均表明，焦亡促进了IVDD的进展。ROS与焦亡和ECM降解密切相关，并在IVDD的发展中也起着同样重要的作用（图1）。另外活性氧的存在促进细胞焦亡和ECM降解。因此，去除活性氧在治疗IVDD中同样至关重要。
图1：临床退行性髓核组织标本的病理改变
2.TMP 纳米颗粒的表征
本研究利用FTIR光谱，SEM 和TEM，元素图谱显微镜，热重分析，全扫描 XPS 测量光谱等表征测定（图2），TA-Mn金属多酚网络具有合成步骤简单、成本效益高且易于执行对的特点，因此它非常适合大规模合成。
图2：TMP纳米颗粒的合成与表征
3.TMP清除ROS的活性能力
在表征 TMP NP后，进一步探讨了它们的 ROS 清除能力。TMP NPs 表现出浓度依赖性的自由基清除速率和能力（图3A-D）。
在化学水平上表征了纳米粒子对 ROS 的 ROS 清除性能后，本研究还观察了细胞中的 ROS 清除性能。在本研究中，IL-1β刺激导致细胞产生过量的ROS，这一点通过氧化应激探针（DCFH-DA）得到证实；相反，与TMP NPs一起孵育后，荧光显著减弱，并且随着TMP NPs浓度的增加，ROS荧光进一步减弱。半定量分析证实了纳米颗粒具有很强的 ROS清除特性（图3E-K）。
以上结果均证实了NPs改善了线粒体活性。
图3：TMP纳米颗粒ROS清除活性
4.TMP@Alg-PBA/PVA 水凝胶释放平台的表征
本研究用FTIR 分析，SEM分析，流变学表征和凝胶降解测试等方法证明了该释放平台的特性有望用于IVD 注射（图4）。
图4：TMP@Alg-PBA/PVA水凝胶释放平台的表征
5.TMP NP 的细胞摄取、溶酶体逃逸和线粒体积累
细胞摄取纳米粒子的效率对于治疗效率至关重要。本研究通过将TMP NP附着在 CY5 荧光上并加载到水凝胶中，观察负载浓度和纳米粒子的吸收效率，并进一步通过细胞活、死染色以及溶血实验证实了100 μg/mL和 200 μg/mL NP的TMP@Alg-PBA/PVA水凝胶表现出良好的生物相容性。
半定量分析，流式细胞术，线粒体追踪器荧光标记等一系列实验表明纳米粒子被细胞吸收后，可以通过溶酶体逃逸释放到细胞质中，然后靶向线粒体区域，以促进TMP更有效地清除ROS（图5）。
图5：MP纳米颗粒的细胞摄取、溶酶体逃逸和线粒体积累
6.TMP@Alg-PBA/PVA水凝胶释放平台对体外细胞焦亡的影响
ROS的积累和线粒体毒性可以通过多种途径介导细胞焦亡。IL-1β是一种极具代表性的促炎因子，用CCK-8 检测试剂盒来量化 IL-1β 对 NPC 死亡的影响。图6A显示了水凝胶与NPC共培养的可视化表示。对每组进行了CCK-8测定，结果表明与Gel组和对照组相比，处理组的细胞活性以浓度依赖性方式显著提高（图6B），PI 染色实验表明凝胶组和对照组的死细胞数量明显高于空白组（图6C）。
细胞膜破裂和裂解代表了细胞焦亡的关键特征LDH 检测试剂 盒显示对照组和凝胶组的LDH水平显著增加。相反，TMP@AlgPBA/PVA组表现出LDH积累减少，表明细胞膜破裂减少（图6D）。此外， SEM显示IL-1β组细胞膜表面的孔数量显著增加，并伴有碎片细胞膜上的球状突起。相反，处理组和空白组的细胞形态表现出伸长和坚固的细胞膜完整性（图6E）。
推论该平台可能通过抑制细胞焦亡来减轻上述现象，并通过RT-qPCR实验，在基因水平上，与其他组相比，治疗组IL-1β和TNF-α mRNA的表达显著降低（图6F），在蛋白质水平上，免疫荧光评估了与细胞焦亡相关的经典蛋白质的表达，证明了该平台的抗焦亡特性。蛋白质印迹分析也证实了相同的结论（图6H）。
图6：TMP@Alg-PBA/PVA对焦亡的影响
7.TMP@Alg-PBA/PVA水凝胶释放平台制造细胞焦亡的潜在机制
为了评估NPC基因表达的变化，进行了高通量 mRNA测序来分析细胞内mRNA的变化（图7A）。治疗组与IL-1β组进行比较时，1472个基因上调，1495个基因下调（图7B），差异基因GO富集分析结果显示DEGs主要与发育过程、细胞对化学刺激的反应、细胞分化、ECM、含有胶原蛋白的细胞外空间、蛋白质或信号通路结合和激活有关。KEGG富集分析结果显示治疗组中TNF信号通路、IL-17信号通路、细胞周期和Toll样受体信号通路的下调（图7D）。IL-17信号通路被显著抑制（图7E）。
作者进一步用WB测定验证了IL-17诱导的细胞焦亡相关信号通路中关键蛋白的表达（图7F）。综上，这些结果表明 TMP@Alg-PBA/PVA 可能通过抑制 NPC中的 IL-17/ERK信号通路来减少细胞焦亡，从而为 IVDD治疗提供新的可能靶点。
图7：转录组测序分析以及WB验证
8.TMP@Alg-PBA/PVA处理后ECM的变化
作者利用IL-1β刺激NPC并模拟炎症环境对ECM的影响。这些结果表明，TMP@Alg-PBA/PVA 平台抵消了IL-1β对ECM的有害影响，显示出IVD修复和再生的前景（图 8）。
图 8. 炎症环境中 TMP@Alg-PBA/PVA 对 ECM 的影响
研究结论
在这项研究中，作者开发了一个多功能和微环境响应的金属-酚网络释放平台(TMP@Alg-PBA/PVA)，该平台装载了TMP NPs，体外研究表明，该平台释放的金属-酚网络(TA-Mn-PVP, TMP)靶向线粒体，有效清除ROS，减少ECM降解。通过抑制IL-17/ERK信号通路抑制焦亡。这些发现证明了该平台的多功能性。另外在IVDD大鼠模型中，TMP@Alg-PBA/PVA通过减缓疾病进展表现出优异的治疗效果（图9.10.11）。
总体而言，该平台具有治疗IVDD的治疗潜力，值得进一步系统的临床前研究。IL-17/ERK信号通路作为该平台对IVDD影响的分子因子的鉴定进一步提供了治疗焦亡的潜在靶点。
